細(xì)胞越來(lái)越受廣大科研者的喜愛(ài),但細(xì)胞不像人們想象中那么強(qiáng)大,在培養(yǎng)復(fù)蘇等過(guò)程中稍有不慎就不可能導(dǎo)致它的死亡。而且它必須是是在無(wú)污染的條件下培養(yǎng),復(fù)蘇才能保證實(shí)驗(yàn)效果。在此公司技術(shù)為您詳細(xì)總結(jié)細(xì)胞的正確冷凍保存方法、保存詳細(xì)步驟,相關(guān)注意事項(xiàng)如下:
一、保存方法(主要有兩個(gè)):
(1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20℃不可超過(guò)1小時(shí),以防止冰晶過(guò)大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
二、步驟:
(1)冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中,*后濃度為5~10%,混合均勻,置于室溫下待用。
(3)依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
(4)離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細(xì)胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中,1ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng):
(1)欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80–90%致密度。細(xì)胞凍存前應(yīng)保證細(xì)胞的活力好,無(wú)污染
(2)冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。
(3)3.一定要保證DMSO的濃度是10%,凍細(xì)胞要舍得用進(jìn)口的DMSO
(4)注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),無(wú)菌且無(wú)色(以0.22micron FGLP Telflon過(guò)濾或是直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用,因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。
(5)慢凍,快解凍。細(xì)胞在 -15 度左右胞內(nèi)形成結(jié)晶對(duì)細(xì)胞損傷,緩慢降溫有助于減少損傷,故放入 -20 度冰箱中凍存可實(shí)現(xiàn)緩慢降溫較為方便,保存時(shí)間過(guò)久會(huì)影響細(xì)胞活力。
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