欧美激情综合一区二区三区,无码精品毛片波多野结衣,后入式抽查日本一区二区三区视频,国产精品久久久久久人潘金莲

 實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行血清抗體檢測(cè)時(shí)，尤其是在疫情發(fā)生情況下，必須采取一些措施防止操作人員感染NiV。血清可以用伽馬射線（6kGy）照射或者用含有0．5％tween-20和0．5％的triton-X100的PBS稀釋后56~0作用30min進(jìn)行病毒滅活。

（1）VNT法檢測(cè)血清抗體。VNT法檢測(cè)血清抗體采用引起50％細(xì)胞培養(yǎng)孔發(fā)生CPE的TCID5。判定法。將待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)NiV病毒液作用后再加到含有Vero細(xì)胞的96孔板中，3天后進(jìn)行觀察。CPE被*抑制的孔判為陽性孔。血清從1：2開始稀釋進(jìn)行檢測(cè)。由于血清本身也會(huì)引起CPE，如果血清本身CPE干擾性太強(qiáng)，可以先讓待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)的病毒液在37~C作用10rain，然后將此混合液和細(xì)胞在37~C作用45min，再傾去此混合液，以減輕血清本身CPE的干擾。對(duì)于質(zhì)量不好的血清，或者量少的血清（如蝙蝠等動(dòng)物的血清）可以從1：5開始稀釋。
被檢血清在10倍以上稀釋時(shí)能夠*抑止CPE，判定為陽性；被檢血清在2-10倍之間稀釋時(shí)能夠*抑止CPE的，判為疑似；其他情況判為陰性。

（2）ELISA法檢測(cè)血清抗體。血清中抗NiV抗體ELISA檢測(cè)所用的抗原一般用NiV感染的Vero細(xì)胞制備，有些血清樣品用此抗原檢測(cè)背景值很高，須用正常Vero細(xì)胞裂解液作為對(duì)照抗原，檢測(cè)這些血清的背景值，zui終以檢測(cè)值和背景值的比值作為判定依據(jù)。國(guó)家外來動(dòng)物疫病診斷中心和AAHL合作，利用大腸桿菌表達(dá)的病毒N蛋白和P蛋白也建立了抗NiV血清抗體檢測(cè)技術(shù)，其步驟和AAHL與馬來西亞獸醫(yī)研究所合作開發(fā)的NiV間接ELISA抗體檢測(cè)的步驟*相似。

①血清處理。實(shí)驗(yàn)人員必須穿防護(hù)服和手套，并且在將該密封板從*拿到外面在56~C加熱30rain之前，消毒他們的雙手和密封的板。在*里，在96孔板的孔上用含有0．5％（體積分?jǐn)?shù)）triton X-100和0。5％（體積分?jǐn)?shù)）tween-20的PBS按照1：5比例稀釋被測(cè)血清。密封此96孔板。然后，每份滅活的血清樣品取22．5PI+和用PBS稀釋100倍的對(duì)照抗原進(jìn)行等體積*混合，并在18-22~C作用30min。然后，每份血清樣品加入405~tL封閉液（含有5％的卵清蛋白和5％的脫脂牛奶）使血清zui終稀釋100倍，在18～22尼帕病毒病作用30min，在兩個(gè)用NiV抗原包被的孔和在另外兩個(gè)用對(duì)照抗原包被的孔中分別都加入100ul這樣稀釋的待測(cè)血清。

②包被抗原。用PBS稀釋對(duì)照抗原和NiV抗原，要確保這兩種抗原蛋白質(zhì)濃度相同?？乖ǔＯ♂尩絣／4000-1／1000。但對(duì)每一批抗原，都應(yīng)確定其合適的稀釋度。按照下面方法向NUNCMaxisorp 96孔微孔板中加入50gL對(duì)照抗原或NiV抗原：第1列、第3列、第5列、第7列、第9列、第11列的孔中加入NiV抗原，在第2列、第4列、第6列、第8列、第10列、第12列的孔中加入對(duì)照抗原，然后37℃振蕩1h，也可以在4℃過夜。

③封閉ELISA板。用含有0．5％tween-20的PBS沖洗ELISA板3次，再加入含有5％脫脂奶粉的PBS，37尼帕病毒病振蕩30min，封閉ELISA板。

④加被檢血清。用PBST沖洗板3次，并加入100uL處理的血清。在酶標(biāo)A蛋白對(duì)照孔和底物對(duì)照孔中加入含有5％卵清蛋白和5％脫脂牛奶的PBS。37℃靜置1h后用PBST沖洗3次。

⑤在含有1％脫脂牛奶的PBST中稀釋酶標(biāo)A蛋白，稀釋為原來的1／3000。仔細(xì)混勻后在每個(gè)孔（除底物對(duì)照孔）中加入100uL。在底物對(duì)照孔中加入100uL含有1％脫脂牛奶的PBST，37℃靜置1h后用PBST沖洗3次。

⑥準(zhǔn)備底物溶液。在10ml 0．05mol／L磷酸緩沖液中溶解一片四甲基聯(lián)苯胺（TMB，1片lmg，Sigma公司， 目錄號(hào)T 3405），并加入2uL新鮮的H202。每孔中加入100uL底物溶液，在18～22℃孵育10min，后每孔加入100uLlmol／L的硫酸，終止反應(yīng)。

⑦以底物對(duì)照孔為空白對(duì)照，測(cè)定各個(gè)孔的450nm處的OD值，并計(jì)算每一份血清樣品的在NiV抗原包被孔OD值（ODNiV和對(duì)照抗原包被孔中OD值（ODCON）之比（OD比）。

⑧結(jié)果判定：①OD比>2．0，并且ODNiv>0．2，判為陽性；②OD比>2．0，并且ODNiv＜0．2，判為陰性；③OD比在2．0和2．2之間的應(yīng)該判為疑似；④疑似和陽性樣品應(yīng)該用VNT進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。